PESQUISA DO CENTRO

Purificação da toxina killer de levedura para o controle de doenças
O setor citrícola enfrenta vários problemas com doenças que ocorrem na pós-colheita como o bolor verde e a podridão azeda, causados por Penicillium digitatum e Geotrichum citri-aurantii respectivamente. O surgimento de linhagens de P. digitatum resistentes aos princípios ativos comumente utilizados durante o beneficiamento dos frutos e a falta de produtos registrados no Brasil para o controle da podridão azeda levam produtores e pesquisadores à busca de métodos alternativos de controle como o uso de leveduras, sendo o fator killer um dos possíveis mecanismos de ação desses antagonistas. Estudos realizados no Laboratório de Fitopatologia e Controle Biológico do Centro de Citricultura Sylvio Moreira identificaram a produção de toxina killer produzida por um isolado da levedura Aureobasidium pullulans contra células sensíveis de Saccharomyces cerevisisae. Diante dessa informação, novos estudos foram realizados com o objetivo de purificar a toxina killer produzida pela levedura e testá-la no controle dos fitopatógenos P. digitatum e G. citri-aurantii. Inicialmente, foram testados diferentes métodos de precipitação proteica; posteriormente, foi determinada a atividade proteolítica e a presença das proteínas β-1,3 glucanase e quitinase, que agem sobre receptores da parede celular. A purificação da toxina foi realizada por cromatografia de exclusão molecular em coluna de gel Sephadex G-75 em tampão formiato de amônio 0,05M, pH 6,0 e cromatografia em coluna de Cellulose (Medium Fibers) em tampão citrato 0,01M, pH 4,6. Posteriormente, a purificação foi confirmada por eletroforese em gel de poliacrilamida e realizada a detecção de atividade killer em meio sólido YEPD-azul de metileno tamponado com citrato-fosfato (0,1 M pH 4,6). A identificação da toxina foi realizada por meio de espectrometria de massas (LC-MSE). Pelos resultados obtidos foi verificado que o melhor método de precipitação proteica foi etanol na proporção 2:1 (v/v etanol/sobrenadante). No estudo sobre o extrato bruto proteico da levedura foi possível observar a presença de enzimas com atividade proteolítica, atividade β-1,3-glucanase e quitinase. Durante o processo de purificação foi possível observar que a toxina killer produzida pelo isolado de A. pullulans é uma proteína de baixa massa molecular pertencente à família das ubiquitinas, que apresenta atividade killer contra os fitopatógenos causadores do bolor verde e da podridão azeda dos citros.

Katia Cristina Kupper e Flávia Lino Pollettini

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